Balkan kökenli göçmen bir ailenin oğlu olan Mustafa İsen, 1953 yılında Sakarya'da doğdu. Mustafa İsen, ilköğrenimini tamamladıktan sonra Çorum İmam Hatip Lisesi'nden mezun oldu.
1975 yılında Atatürk Üniversitesi Edebiyat Fakültesi Türk Dili ve Edebiyatı Bölümü'nden mezun olduktan sonra İstanbul'da öğretmenlik yapmaya başladı. Atatürk Üniversitesinde asistanlık yaptı. 1981 yılında Türkiye Cumhuriyeti Millî Eğitim Bakanlığı aracılığı ile Belgrad Üniversitesi Filoloji Fakültesi Doğu Dilleri Bölümüne öğretim elemanı olarak görevlendirildi ve 1983 yılına kadar burada görev yaptı. Aynı yıl yardımcı doçent tayin edildi ve yurda dönüşünden sonra Atatürk Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Türk Dili ve Edebiyatı Bölümünde öğretim üyesi olarak çalıştı.
Bu yıllarda kuruluş aşamasında olan Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Türk Dili ve Edebiyatı Bölümünde de alanıyla ilgili dersler verdi. 1988 yılında Millî Eğitim Bakanlığı'nda müşavir olarak görevlendirildi. Aynı yıl, Eski Türk Edebiyatı alanında doçent oldu ve 1989 yılında Gazi Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Türk Dili ve Edebiyatı Bölümü'ne doçent olarak atandı. Gazi Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Dekan yardımcılığı ve Gazi Üniversitesi Türkçe Öğrenim Uygulama ve Araştırma Merkezi Başkanlığı (G.Ü. TÖMER) yaptı.
1994 yılında Profesör oldu. Ahmet Yesevi Uluslararası Türk-Kazak Üniversitesi Sosyal Bilimler Enstitüsü'nde müdürlük, Gazi Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Türk Dili ve Edebiyatı Bölümünde Bölüm Başkanlığı yaptıktan sonra aynı üniversitede Fen-Edebiyat Fakültesi dekanı oldu (1997). 2000 yılında Başkent Üniversitesi'ne geçti ve burada Türk Dili ve Edebiyatı Bölümünü kurdu.
17 Aralık 2002 tarihinde Kültür Bakanlığı Müsteşarlığına atandı. Kültür ve Turizm Bakanlıklarının birleşmesi sonucu 17 Haziran 2003 tarihinde Kültür ve Turizm Bakanlığı Müsteşarlığına tayin edildi. Türk Edebiyatı ve Balkanlarda Türk kültürü ile ilgili yayınlanmış çok sayıda çalışması yaptı. İsen, halen Türkiye-Sırbistan Dostluk Grubu başkanlığı görevini yürütmektedir.
22 Temmuz 2007 genel seçimlerinde AK Parti'den milletvekili adayı olmak için müsteşarlıktan istifa etti. Sakarya veya Bursa'dan Ak Parti aday listesine konulacağı beklenirken son gece listeye konulmasının unutulduğu anlaşıldı. 5 Temmuz'da da müsteşarlık görevine döndü. 28 Ağustos 2007'de Abdullah Gül'ün Cumhurbaşkanlığa seçilmesinin ardından Cumhurbaşkanlığı Genel sekreterliğine atandı. Aynı zamanda 4 Nisan 2003 tarihinden beri Ahmet Yesevi Uluslararası Türk-Kazak Üniversitesi Mütevelli Heyet üyesidir ve 17 Ekim 2009 tarihinden de itibaren YÖK üyeliğine atandı.
Recep Tayyip Erdoğan'ın cumhurbaşkanı seçilmesiyle beraber cumhurbaşkanlığı başdanışmanlığına atandı.1 Haziran 2015 seçimlerinde AK Parti'den milletvekili adayı olmak için görevinden istifa etti. 25. ve 26. Dönemlerde Ak Parti'den Sakarya Milletvekili olarak seçilen İsen, TÜRK-PA, Millî Eğitim, Kültür, Gençlik ve Spor Komisyonu üyesi ve Türkiye Sırbistan Dostluk Grubu Başkanıdır. Ayrıca Türk Dünyası Akil Adamlar Meclisinde Türkiye'nin Aksakalı.